RESÚMEN
Desde la utilización del Plasma Rico en Plaquetas (PRP) en los procedimientos quirúrgicos periodontales regenerativos, se han descrito diversos protocolos para su obtención, siendo cada uno de estos diferentes en cuanto al tiempo y número de revoluciones utilizadas durante el centrifugado de la sangre tomada del paciente. Sabemos que el producto final obtenido mediante los protocolos descritos, es el denominado PRP, pero existe la interrogante de cual de ellos ofrece el plasma con mayor número o concentración de plaquetas. Es conocido que a mayor cantidad de estos elementos, los resultados de la cicatrización o de la regeneración del lecho quirúrgico se verán incrementados y se disminuirá el riesgo de complicaciones postoperatorias. El objeto de este estudio es evaluar cuál de los cuatro protocolos seleccionados (Anitua y Andía, 2000; De Obarrio y col, 2000 y Camargo y Leckovics, 2002; Okuda y col (2003) y Kawase y col (2003); y García y col, 2005) proporciona el PRP con mayor cantidad de plaquetas, al ser sometidos a las variables de tiempo y velocidad de centrifugación diferentes preestablecidas por cada autor.

Se realizó la toma de 5 muestras de sangre de 6 pacientes y se sometieron al proceso de obtención del PRP según los parámetros de los 4 protocolos nombrados. Luego se procesaron para determinar la cantidad de plaquetas presentes y así conocer de cuál de los cuatro protocolos estudiados se obtiene el PRP con mayor concentración plaquetaria.

INTRODUCCIÓN
Las plaquetas son células sanguíneas enucleadas contenidas en el plasma sanguíneo, y aunque poseen una estructura compleja, son pequeños discos redondos u ovales de 2 a 4 µ de diámetro cuya concentración normal en sangre oscila entre 150.000 y 300.000 por microlitro (Guyton y Hall, 1997; Anitua y Andia, 2000; Marx y Garg, 2005). En ellas se encuentran los llamados gránulos alpha a que contienen un grupo de factores de crecimiento (FC) que, al liberarse, hacen posible la multiplicación y el desarrollo de las células endoteliales vasculares, de las células musculares lisas y de los fibroblastos, y ejercen múltiples efectos sobre los fenómenos de remodelación celular (Barnes y col, 1999; Anitua, 2001; Marx y Garg, 2005), permitiendo que interactúen recíprocamente con los leucocitos y con las células endoteliales para modular la reacción inflamatoria en los procesos de cicatrización y de regeneración tisular (Klinger, 1997; Bazzoni y col, 1999). La mayoría de éstos FC son proteínas de bajo peso molecular que varían entre 1.000 y 4.000 daltons. Cada factor posee un tejido u órgano sobre el cual actuar, aunque todos los tipos de células responden a uno o más factores al mismo tiempo (Benito, 1991; Graves y Cochran, 1994; Marx y Garg, 2005).

Las plaquetas tienen una semi-vida útil de 8 a 12 días, al final de la cual acaba su ciclo vital y después son eliminadas de la circulación principalmente por el sistema de macrófagos titulares (Guyton y Hall, 2001) (ver Gráfico No. 1).



Gráfico No. 1: Plaquetas. Tomado de: http://health.upenn.edu/News/News_Releases/platelet.jpg

El PRP es una concentración autóloga de plaquetas humanas en un volumen pequeño de plasma que representan un aumento de plaquetas sobre la línea normal, siendo así una fuente de fácil acceso a los FC contenidos en ellas, permitiendo así acelerar y mejorar los procesos de cicatrización y de regeneración tisular. Es definido como una concentración autóloga de plaquetas humanas en un volumen pequeño de plasma. Por consiguiente, el término PRP se refiere al gel o concentrado de plaquetas autólogas o plasma rico en FC. Al ser un agregado de plaquetas contiene los cinco FC o proteínas fundamentales que son secretados al activarse las mismas cuando se inicia el proceso de cicatrización de las heridas (Anitua y Andía, 2000; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005).

El PRP es otra forma normal de coágulo sanguíneo autólogo que contiene un número favorablemente elevado de plaquetas y presenta un pH entre 6,5 y 6,7. Proviene de la propia sangre del paciente, por lo cual está libre de enfermedades trasmisibles y no puede causar reacciones de hipersensibilidad. La cuenta de plaquetas requerida en un coágulo para calificar como PRP puede ser discutible, pero una concentración de aproximadamente 1 millón de plaquetas/µL, o de 4 a 7 veces sobre su cuenta básicamente usual (200.000 plaquetas/µL), ha demostrado proporcionar beneficios clínicos (Marx y col, 1998; Marx y col, 2001; Marx y Garg, 2005).

Un coágulo de sangre normal contiene 93% de células de rojas, 6% de plaquetas y en algunos casos menos de un 1% de células blancas; en contraste, un coágulo de PRP contiene 94% de plaquetas, sólo un 5% de células rojas y un 1% de células blancas. Esta alteración de las proporciones celulares de las células que no estimulan la cicatrización (células rojas) por las que si estimulan todas las fases de la cicatrización (plaquetas), es lo que explica su habilidad en reforzar la regeneración tisular. La estrategia simple y beneficiosa del PRP es aumentar las acciones de los FC en regenerar los tejidos a través del aumento de la cantidad de plaquetas (Marx y col, 1998; Marx y col, 2001; Anitua, 2001; Anitua 2001b; Gruber y col, 2002; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005).

A finales de los años noventa, Whitman y col (1997) introdujeron el uso del PRP en el área de la cirugía bucal, el cual ha sido aceptado ampliamente como una nueva biotecnología que es parte del interés creciente en la ingeniería tisular y la terapia celular actual, aunque se considera a Robert Marx como uno de los emprendedores de ésta nueva biotecnología. En el área de la Periodontología se ha planteado el empleo del PRP para el relleno de defectos óseos producto de la enfermedad periodontal, como complemento de la Regeneración Periodontal y Ósea Guiada y en la estimulación de la regeneración de los tejidos blandos, a través de la promoción del crecimiento y la diferenciación de las células epiteliales, células conectivas, células del ligamento periodontal y las células óseas (Marx y col, 1982; Marx y col, 1990; Marx y col, 1998; Anitua y Andia, 2000; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005).

OBTENCIÓN Y ACTIVACIÓN DEL PLASMA RICO EN PLAQUETAS
Recientemente ha surgido una creciente demanda del PRP en el campo de la cirugía odontológica (Marx y col, 1982; Marx y col, 1990), por lo que se han desarrollaron dispositivos pequeños y compactos que proporcionan cantidades de PRP a través de la toma de poca sangre del paciente, los cuales tienen amplia aceptación en ésta área. El clínico debe tener presente que cualquier dispositivo de PRP debe procesar una concentración aproximada de 1.000.000 plaquetas /µL en 5 ml de volumen de sangre; éste debe ser un proceso viable, estéril y libre de pirógenos para que las plaquetas se mantengan ilesas (Anitua y Andía, 2000; Marx, 2001; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005).

La obtención de las plaquetas y su concentración se inician con asepsia y una técnica con mínimo traumatismo para obtener un pequeño volumen de sangre, normalmente entre unos 10-60 ml, dependiendo de la extensión y el tipo de cirugía (Anitua y Andía, 2000; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005).

Para que ésta no coagule inmediatamente, la muestra se coloca en un recipiente estéril (tubo de ensayo) con 45,83,100 citrato sódico al 3,8% como anticoagulante, ya que esta solución capta los iones calcio que se encuentran en la sangre y los neutraliza formando un compuesto químico llamado quelato impidiendo de esta manera la coagulación sanguínea, además, el citrato sódico no altera los receptores de membrana de las plaquetas y permitirá revertir el proceso al añadir calcio en forma de cloruro de calcio. Se coloca 1ml de anticoagulante por cada 5ml de sangre y ambos se mezclan moviendo el tubo o la jeringa por inversión (Pierce y col, 1992; Anitua y Andía, 2000; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005).
 
La sangre autóloga anticoagulada se coloca entonces en el dispositivo para su centrifugación. Marx, en su técnica de obtención del PRP, emplea un dispositivo (SmartPRep®) de centrifugación doble. El primer giro llamado giro fuerte o giro de separación, es a una velocidad de 5.600 rpm, obteniendo la separación de las células rojas (glóbulos rojos) del resto de los componentes de la sangre. El segundo giro llamado giro suave o giro de concentración, es a una velocidad de 2.400 rpm, que separa y une fuertemente a las plaquetas, células blancas y un pequeño número de células rojas residuales del plasma. Este giro suave produce el PRP y lo separa del plasma pobre en plaquetas (PPP) ambos procedimientos se realizan en un tiempo total de    15 minutos aproximadamente (Marx y col, 1998; Anitua y Andía, 2000; Marx y Garg, 2005).

Marx y col (1998) y Marx (2000) afirman queintentar obtener PRP con un solo giro no produciría un verdadero concentrado terapéutico. En cambio se obtiene una mezcla de PRP y plasma pobre en plaquetas (PPP) que contiene poca cantidad de plaquetas. Esto se debe principalmente a que mediante la realización de un solo giro, las células rojas interfieren con la separación de las plaquetas. Este es el principal error que ocurre con las centrífugas convencionales de laboratorio, ya que éstas son diseñadas con propósitos diagnósticos y no para el desarrollo del PRP. Dichos dispositivos no producen un rendimiento suficiente y pueden lesionar a las mismas (Marx y col, 1998; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005).

Luego del segundo giro de concentración, la sangre es separada en sus tres componentes básicos en función a su densidad del menos denso al más denso. Plasma pobre en plaquetas (PPP) primero, plasma rico en plaquetas (PRP) de segundo y por último las células rojas (CR) que son las más densas. El componente del PPP es el plasma acelular, que cuenta con aproximadamente 200 cc de volumen, el componente de las células de sangre rojas se condensa esencialmente y cuenta con aproximadamente 180 cc de volumen. El PRP es el plasma con un número concentrado de plaquetas y células de sangre blancas (Marx, 2001) (ver Gráfico No. 2).



Gráfico No. 2: Separación de la sangre en sus tres componentes básicos en función de su densidad. Tomado de: http://plasmarico.com.ar/prp2.asp

A diferencia de Marx y Garg (2005), Anitua y Andía (2000) y Anitua (2001) obtienen el PRP en un proceso de una sola fase, centrifugando el plasma a 1.800 rpm durante 8 minutos, separando los componentes sanguíneos en varias fases. (Gráfico No. 3).

Gráfico No. 3: Proceso de centrifugación del PRP. Foto del autor

En el fondo del contenedor quedan igualmente las células rojas. La fase superior amarillenta se subdivide en tres fases: una fracción 1 (superior) que corresponde al PPP, luego la fracción 2 (intermedia), que representa un plasma con un número de plaquetas similar al que presenta la sangre periférica, y por último, la fracción 3 (inferior) que es el PRP (Anitua y Andía, 2000; Anitua y Andía, 2001) (ver Gráfico No. 4).

Gráfico No. 4: Fracciones de la separación del plasma. Tomado de: http://profesional.medicinatv.com/fmc/anitua/

Luego del proceso de centrifugación, la fracción del PRP es separada y tomada por medio de un pipeteado y colocada en un tubo estéril, donde permanecerá anticoagulado hasta que el proceso de coagulación sea inducido. El PRP debe permanecer estéril para que las plaquetas sean viables y bioactivas durante las próximas 8 horas desde que se obtuvieron a temperatura ambiente (Anitua y Andía, 2000; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005). Se recomienda que el PRP sigua anticoagulado hasta que se active, para poder ser colocado de esta manera en el sitio quirúrgico. No se aconseja almacenar este concentrado por más de 8 horas, ya que su viabilidad no se ha probado en horarios extendidos a este tiempo y la congelación puede lesionar o romper las membranas de las plaquetas (Marx y Garg, 2005).

Desde que se desarrolló el PRP en el área odontológica sólo se requiere una pequeña cantidad de sangre y el proceso entero puede completarse en sólo 15 minutos o menos. Se recomienda desechar cualquier PRP si no se usa después de 8 horas y desarrollar un segundo proceso (Marx y Garg, 2005).

La activación del PRP requiere reemplazo del calcio y la iniciación de la cascada de la coagulación sanguínea. Para Anitua y Andía (2000), Marx (2004) y Marx y Garg (2005), esto se logra agregando cloruro cálcico. Marx emplea conjuntamente con esta solución trombina bovina, a diferencia de Anitua y Andía (2000) que no describen su empleo, ya que existen ciertas controversias con la utilización de la misma porque se han detectado anticuerpos antitrombina en pacientes que han sido tratados con este producto (Anitua y Andía, 2000; Anitua, 2001; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005).

El usar una mayor cantidad de solución activadora es contraproducente; un mayor volumen de esta solución no acelerará el proceso de la coagulación, más bien, reduce su velocidad de formación o la inhibe totalmente, ya que esto diluye la concentración del fibrinógeno que es un factor importante en la formación del coágulo (Knighton y col, 1984; Marx y Garg, 2005).

OBJETIVO
El objetivo del presente estudio es determinar el número de plaquetas contenidas en el PRP obtenido mediante cada uno de los cuatro protocolos de centrifugación escogidos, los cuales difieren en el número de revoluciones y en el tiempo de centrifugado entre sí (ver Tabla No.1), para conocer de ésta forma cuál de ellos ofrece el mayor número de plaquetas.´

4- MATERIALES Y METODOS
Un  total de cinco (5) muestras de sangre fueron obtenidas de 6 pacientes sistémicamente sanos, cuatro se sometieron al centrifugado según cada protocolo: el primero propuesto por Anitua y Andía (2000) a 1800 rpm por 8 minutos; el segundo de De Obarrio y col (2000) y Camargoy col (2002)  a 5600 rpm por 6 min; el tercero de Okuda y col (2003) y Kawasey col (2003) con un centrifugado inicial de 2400 rpm durante 10 minutos, seguido de otro centrifugado del plasma aislado de 3600 rpm por 15 minutos; y el cuarto y último protocolo propuesto por García y col (2005) con un centrifugado inicial de 1800 rpm por 8 minutos seguido por un segundo centrifugado sólo del plasma obtenido a 1800 rpm por 8 minutos. La quinta muestra se dejó sin centrifugar para determinar el número de plaquetas en condiciones normales. Se realizó el contaje por medio del sistema automatizado de la máquina Coulter® para análisis hematológico (ver Tabla No.2).

TABLA Nº 1: Autores de los protocolos utilizados



TABLA Nº2: Descripción de la centrifugación de los protocolos utilizados.



RESULTADOS
El mayor número de plaquetas obtenido equivalente a un promedio de 191.31 % del contaje promedio inicial fue contado en el PRP obtenido según el protocolo número 4 propuesto por García y col (2005), seguido por el número 1 de Anitua y Andía (2000) donde se obtuvo un promedio de 90,31 %, luego el número 3 de Okuda y col (2003) y Kawasey col (2003) con un promedio del 31.74 %, y por último, el número 2 de la técnica de De Obarrioy col (2000) y  Camargo y col (2002) con un contaje promedio de 5.29 %. En ninguno de los protocolos se logró obtener más del 200 % de concentrado plaquetario (ver tabla No.3).




DISCUSION
Muchos estudios han evaluado diferentes dispositivos y/o protocolos para obtener PRP. Uno de éstos fue el presentado por Weibrich y Kleis (2002) donde se compararon dos métodos: el Curasan PRP Kit® de Alemania y el PCCS PRP system® de Estados Unidos de Norte América. Se extrajo sangre de 47 donantes sistémicamente sanos, con edades comprendidas entre 20 y 59 años y se preparó el PRP de cada uno de ellos con ambos sistemas. Los resultados difirieron significativamente, encontrándose que con el sistema PCCS PRP system® la concentración y el recuento de plaquetas fue mucho mayor (901.999 a 2.209.000) que el obtenido al emplear el sistema Curasan PRP Kit® (636.000 a 1.075.000). Los resultados de éste estudios difieren significativamente de nuestros resultados, los cuales están muy por debajo de éstos números.

Por su parte, Appel y col (2002) compararon tres preparaciones diferentes para obtener el concentrado de plaquetas. Una de estas fue Curasan PRP Kit®, el PCCS PRP system® y un procedimiento rutinario empleado en laboratorios de transfusiones. Se tomaron las muestras de sangre de 12 voluntarios y se emplearon los tres sistemas, obteniendo los siguientes resultados: el incremento absoluto de plaquetas parece ser mayor con el PCCS PRP system®, la más alta concentración por μl se ganó con el sistema Curasan PRP  Kit® y finalmente los autores reportan que el sistema de laboratorio puede ofrecer una alternativa, si el sistema intraoperatorio no está disponible, aunque con éste se obtiene una concentración muy pobre de PRP, coincidiendo con nuestros resultados.

Weibrich y col (2003) compararon el sistema Harvest Smart PReP system® (Alemania) con el Friadent-Schütze platelect rich plasma kit® (Austria). Se extrajo sangre de 54 donantes sanos, con edades comprendidas entre 23 y 79 años y se obtuvo PRP de cada paciente por ambos métodos. El dispositivo de Smart PReP® fue el sistema con mejor facilidad de manejo, mejor tiempo operatorio y tuvo una mayor eficacia en la recolección de plaquetas que el kit de Friadent-Schütze®, ya que éste sólo ofrece una ligera ventaja en la concentración de plaquetas del PRP  resultante. Aunque no reportan en número de plaquetas obtenido, sus conclusiones se acercan más a los resultados obtenidos según el protocolo de Garcia y col (2005).

Si los resultados obtenidos en las investigaciones son diferentes, es lógico pensar que esto puede estar influenciado por el empleo de distintos dispositivos y equipos de evaluación, y de distintos protocolos de obtención del PRP. Es necesario entender que el verdadero PRP es obtenido con máquinas calificadas para tal fin; dispositivos en mal estado pueden alterar las proporciones y la calidad del PRP y su beneficio no será el mismo si se compara con el obtenido por una centrífuga certificada (Marx y Garg, 2005). 

CONCLUSIONES
El PRP es una preparación autóloga inherentemente seguro, libre de enfermedades transmisibles, lo que representa relativamente una nueva biotecnología que es parte del interés creciente en la ingeniería  tisular y la terapia celular de hoy día, el cual es obtenido mediante un procedimiento sencillo y económico.

Desde que se planteó el empleo del PRP en odontología, esta biotecnología ha gozado de gran popularidad dentro del área de la cirugía bucal, periodontal, y maxilofacial.

Es importante analizar detalladamente la diversidad de  resultados obtenidos en los estudios publicados, partiendo inicialmente por la diferencia entre los dispositivos de medición que se emplearon para cada variable, ya que para realizar una comparación certera y aceptable, se hace necesario que se empleen dispositivos estandarizados que les permitan la cuantificación y evaluación de cada componente tisular en cada fase del proceso de cicatrización.

Indudablemente, los odontólogos involucrados con la regeneración tisular tienen algo que esperar del PRP. Sin embargo, en esta fase temprana de estudio, todavía es mucho lo que queda por investigar y descubrir, y un cuerpo adecuado debe preceder el uso extendido de este material, como ocurriría con cualquier otro agente biológico. Un buen diseño, ensayos humanos rigurosos y estandarizados deben demostrar su beneficio.

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